Chromatografia wykluczenia zależnego od wielkości cząsteczek (SEC), zwana także chromatografią żelowo-permeacyjną lub chromatografią sita molekularnego) jest metodą chromatografii kolumnowej dedykowaną do badań np. polimerów począwszy od oczyszczania do kontroli jakości czy określania zależności struktura-właściwość. Metoda ta pozwala na rozdzielanie cząsteczek polimerów w roztworze w oparciu o wielkość tych cząsteczek niezależnie od użytego rozpuszczalnika (eluenta) i sposobu otrzymania makrocząsteczki. Pozwala zatem wyznaczyć liczbowo średnią ( \( {M}{_n} \)) i wagowo średnią( \( {M}{_w} \)) masę cząsteczkową polimeru, a na ich podstawie rozkład masy cząsteczkowej ( \( {M}{_W}{_D} \)).

Rozdzielanie zachodzi w kolumnie chromatograficznej, która zazwyczaj składa się z pustej rurki wypełnionej upakowanymi porowatymi cząstkami sferycznymi (perełkami) (faza stacjonarna, wypełniacz kolumny) ( Rys. 1 ) i jest procesem napędzanym przez entropię. Pory mogą mieć postać wgłębień na powierzchni lub kanałów przechodzących przez „perełki”. Próbka (rzędu kilku miligramów na pomiar) jest rozpuszczana w rozpuszczalniku, który jest stosowany jako faza ruchoma (eluent), a następnie wstrzykiwana na kolumnę. Roztwór przemieszcza się w dół kolumny, a niektóre jego cząsteczki dyfundują do porów. Rozdział cząsteczek odbywa się na podstawie zróżnicowania dróg i czasu dyfuzji wewnątrz porów wypełnienia kolumny, o różnych średnicach ( \( \phi{_p}{_o}{_r}{_ó}{_w} \)), dla cząsteczek o różnych wartościach średnicy hydrodynamicznej ( \( \phi{_c}{_z}{_ą}{_s}{_t}{_e}{_c}{_z}{_e}{_k} \)). Kolejność wymywania jest związana z zatrzymywaniem cząsteczek w porach wypełnienia kolumny. To znaczy, podczas przepływu próbki przez kolumnę, zawarte w próbce cząsteczki małe łatwo dyfundują do wnętrza porów i dłużej w nich przebywają, przez co wydłuża się ich czas retencji w stosunku do czasu retencji dla cząsteczek większych. Rys. 1 ilustruje ten proces. Cząsteczki większe ze względu na mniejszą liczbę dostępnych dla nich porów w ziarnach wypełnienia kolumny wnikają trudniej lub nie wnikają do porów i w trakcie wymywania przemieszczają się pomiędzy ziarnami złoża w stronę wylotu kolumny, a zatem w pierwszej kolejności są wymywane. Ponieważ wszystkie cząsteczki jednocześnie podlegają dyfuzji, cząsteczki małe, które dostały się do wnętrza porów, po jakimś czasie wydostają się na zewnątrz i są transportowane przez fazę ruchomą w kierunku wylotu kolumny. Czas przebywania cząsteczek wewnątrz porów jest proporcjonalny do ich wielkości ( objętości hydrodynamicznej ), to znaczy im cząsteczki są mniejsze, tym dłużej są zatrzymywane wewnątrz porów i tym później wymywane. W ten sposób rozdzielone cząsteczki są uporządkowane zgodnie z ich wielkością, a następnie charakteryzowane za pomocą jednego lub więcej detektorów. Najczęstszym detektorem jest refraktometr różnicowy, który wykrywa zmiany współczynnika załamania eluowanego roztworu. Otrzymany chromatogram (zależność sygnału od objetości eluenta (w jednostkach: mL) lub czasu retencji (w jednostkach: s) jest zatem rozkładem masy polimeru w funkcji czasu retencji.

W metodzie SEC istnieją ograniczenia dotyczące zakresów wielkości (mas) cząsteczek, które mogą zostać rozdzielone. Minimalna masa cząsteczkowa, która nie może dostać się do porów nazywana jest granicą wykluczenia. To znaczy, że cząsteczki większe niż granica wykluczenia kolumny nie mogą zostać rozdzielone. Dlatego, wielkość porów wypełniacza kolumny należy wybrać zgodnie z zakresem wielkości makrocząsteczek, które mają zostać rozdzielone. W przypadku separacji polimerów rozmiary porów wypełniacza kolumny powinny być rzędu analizowanych polimerów. W sytuacji gdy próbka polimerów zawiera cząsteczki o szerokim zakresie mas cząsteczkowych do całkowitego rozdzielenia próbki zazwyczaj stosuje się kilka kolumn w tandemie.

Wymiar i upakowanie kolumny, prędkość przepływu eluenta i selektywność wypełniacza (rozkład wielkości porów czy oddziaływania pomiędzy próbką, a wypełniaczem) to czynniki wpływające na rozdzielczość tej metody (odległość między dwoma pikami).

Równanie ( 1 ) opisuje zależność pomiędzy objętością eluenta ( \( {V} \)), a masą cząsteczkową ( \( {M} \)) polimerów, gdzie: \( {b} \) i \( {c} \) są stałym.

Wykres tej zależności nosi nazwę krzywej kalibracji. Krzywe kalibracyjne przygotowuje się przy wykorzystaniu polimerów o znanych masach cząsteczkowych w celu wyznaczenia objętości eluenta i wykreślenia logarytmu masy cząsteczkowej w funkcji objętości eluenta lub czasu retencji. Cząsteczki o rozmiarach większych od rozmiarów porów wypełniacza przechodzą pomiędzy ziarnami wypełniacza (limit wykluczenia \( {V}{_o} \)). Cząsteczki o rozmiarach poniżej pewnego rozmiaru wnikają w pory i ulegają wymywaniu prawie w tym samym położeniu. Nazywa się to granicą przenikania ( \( {V}{_c} \)). Krzywa kalibracji obowiązuje w zakresie między granicą wykluczenia, a granicą przenikania. W tym zakresie im większa cząsteczka, tym szybciej jest wymywana, a im mniejsza cząsteczka, tym później jest wymywana. Krzywe kalibracyjne o dużym nachyleniu uzyskuje się dla wypełniaczy o dużych rozmiarach porów (do pomiaru większych cząsteczek), a krzywe o łagodnym nachyleniu uzyskuje się dla wypełniaczy o małych rozmiarach porów (do pomiaru mniejszych cząsteczek). Im łagodniejsze nachylenie krzywej, tym większa różnica w objętości eluenta pomiędzy pikami dla polimerów o małych różnicach w masie cząsteczkowej, czyli tym większa rozdzielczość metody [1], [2], [3].